خدمات ژنومیکس > تعیین توالی DNA

لطفاً جهت سفارش کلیک نمایید.

فهرست

  1. خدمات شرکت فزا پژوه
  2. قیمت خدمات
  3. میزان حجم و غلظت مورد نیاز
  4. نحوه آماده سازی صحیح نمونه
  5. فهرست پرایمر های Universal موجود در آزمایشگاه
  6. نتایج نا مطلوب همراه با علل آن ها
  7. درخواست تکرار
  8. نکات مفید
  9. معرفی تعیین توالی
  10. روش های متداول انجام تعیین توالی
  11. معرفی روش  Sanger Sequencing
  12. تعیین توالی شکاری یا  Shotgun Sequencing
  13. نسل جدید تعیین توالی  Next Generation Sequencing
  14. معروفترین شرکت های سازنده دستگاه های Genetic Analyzer یا   Sequencer
  15. مهمترین پایگاههای داده اطلاعات تعیین توالی
  16. gDNA Sequencing & Primer Walking

خدمات شرکت فزا پژوه:

  • تعیین توالی همراه با مشاوره علمی از سال 1377 تا کنون
  • دستگاه و مدل: ABI 3730 XL   
  • روش تعیین توالی: Sanger Sequencing method  
  • قابلیت خوانش تا 850bp برای قطعاتی با ماکزیمم طول 1300 bp با خوانش دوطرفه Forward & Reverse
  • انجام  Primer walking برای قطعات طویل تر
  • امکان تعیین توالی DNA Genomic
  • قابلیت سنتز و نگهداری پرایمرها درStock آزمایشگاه مربوطه جهت استفاده در سفارشات بعدی
  • ارائه پروتوکل ویژه جهت تعیین توالی نمونه های GC Rich بدون دریافت هزینه مازاد
  • امکان استفاده رایگان از پرایمرهای Universal موجود در آزمایشگاه
  • تحویل نتایج 15 - 10 روز کاری پس از ارسال نمونه ها 
  • ارسال نمونه ها به صورت هفتگی
  • عدم دریافت هزینه حمل نمونه ها
  • ارائه خدمات متنوع بیوانفورماتیک و مشاوره علمی
  • تخفیف ویژه در صورت ارسال نمونه های بیشتر

بهای خدمات:

با توجه به افزایش نرخ ارز و ...، لطفاً جهت اگاهی از بهای خدمات با ما درتماس باشید.

شرح قیمت (ريال)
تعیین توالی / واکنش

 
خالص سازی / واکنش

 

 

میزان حجم و غلظت مورد نیاز:

غلظت و حجم نمونه ها و پرایمرها برای انجام یک Reaction باید مطابق جدول ذیل باشد :
 

 
 
نحوه آماده سازی صحیح نمونه:
 

1- نمونه ها و پرایمرها را فقط در PCR Plate یا Tube ml 5/1 ویا 1/5 ml Screw Cap Tube  ارسال نمایید.

2- نام نمونه ها را به وسیله ماژیک CD روی تیوب ها نوشته و بر روی آنها چسب بزنید.

3- دقت نمائید، در جداره کناری تیوب‏ها فقط نام نمونه قید شود و سعی نمائید طول تعداد کلمات بیشتر از 4 کاراکتر نباشد.

4- از بکار بردن اسامی فارسی خودداری نمائید.

5- دقت نمائید نمونه‏‏ DNA ارسال شده باید به شکل یک قطعه PCR Product بدون هرگونه باند غیر اختصاصی و یا plasmid باشد.

6- از تیوب های قفل شونده و یا درب پیچ دار جهت جلوگیری از ریزش/ نشت نمونه استفاده نمائید.

7- به منظور جلوگیری از تبخیر، نشت و ریزش نمونه ها از پارافیلم استفاده نمایید.

8- نمونه های DNA و پرایمرها حتما در آب مقطر حل شوند. همچنین می توان برای این کار از:

 محلول 10mM Tris-Hcl (pH 8)یا محلول 10mM Tris-Hcl (pH 8) به همراه حداکثر 0.01mM EDTA برای نگهداری طولانی مدت استفاده کرد.

دقت نمائید بافر TE استاندارد برای حل کردن، مناسب نمی باشد چراکه غلظت بالاتر EDTA فعالیت پلیمرازی را مختل می کند.

لطفا دقت نمائید در صورتیکه نمونه ها به صورت تیوب های منفرد ارسال می شوند، تنها نمونه هایی که در تیوب های 1.5 ارسال شده باشند پذیرفته خواهند شد.

 
فهرست پرایمر های Universal موجود در آزمایشگاه:
 

 
 نتایج نامطلوب و علل آنها:
 
به طور کلی دانشمندان 3 دلیل عمده دریافت نتایج نامطلوب را ذکر کرده اند:
  1. کیفیت نامطلوب نمونه : BAC, Fosmid, Cosmid, Plasmid, PCR Product
  2. طراحی یا کیفیت نامطلوب پرایمر 
  3. خطای اپراتور، مواد مصرفی و یا تجهیزات

1. مهمترین دلایل کیفیت نامطلوب نوکلئیک اسید: 

  1. حجم ناکافی: خطای محقق هنگام انجام پیپتینگ، نشتی نمونه از درب و یا از محل شکستگی ویال قبل و یا در حین حمل و نقل، تبخیر و خشک شدن نمونه به دلیل استفاده از ویال نامرغوب
  2. غلظت ناکافی: غلظت پایین و یا بالاتر از پروتوکل اعلام شده آزمایشگاه 
  3. وجود باند غیر اختصاصی
  4. وجود ناخالصی و مهار کننده های مختلف
  5. وجود ساختار های ثانویه
  6. وجود توالی های هترو و یا همو پلیمر
  7. و... 
 
2. مهمترین دلایل طراحی بد و کیفیت نامطلوب پرایمر:
  1. طراحی نامطلوب و غیر اختصاصی پرایمر
  2. حجم ناکافی
  3. غلطت ناکافی: غلظت پایین تر و یا بالاتر از پروتوکل اعلام شده آزمایشگاه
  4. ناخالصی های همراه پرایمر 
  5. و...

3. مهمترین دلایل خطای اپراتور، مواد مصرفی و یا تجهیزات:

  1.  خطای انسانی اپراتور
  2. خطای مواد مصرفی و محلول های کاربردی
  3. خطای دستگاه 

 

نکته بسیار مهم:

کیفیت نامطلوب نمونه و پرایمر:

بیشترین آمار مربوط به دریافت نتایج نامطلوب مربوط به این دو مورد می باشد. آزمایشگاه هایی که از توانایی علمی و تجهیزاتی روند کنترل کیفی خوانش نمونه برخوردارند با دریافت مبلغی مشخص قادر به کنترل نمونه قبل از خوانش هستند بدین گونه در صورت احتمال بالای دریافت نتایج بد، محقق را از این مورد آگاه خواهند ساخت تا محقق بنا به صلاحدید و مسوولیت خود نسبت به ارسال نمونه مجدد و یا خوانش همان نمونه تصمیم گیری نماید. به صورت معمول این روند عبارت است از انجام روش های کیفی و کمی کنترل نمونه، انجام ژل الکتروفورز (دستی و یا سیستم اتوماسیون)، خوانش غلظت نوکلئیک اسید و پرایمر با نانو دراپ و ...

ما قادر هستیم در صورت درخواست محقق روند کنترل کیفی را انجام دهیم.

خطای اپراتور، مواد مصرفی و یا تجهیزات:

با توجه به تجربیات بسیاز از سال 1377تا کنون، دریافته ایم آخرین احتمال مربوط به دریافت نتیجه نامطلوب مربوط به این مورد است. زیرا آزمایشگاه های معتبر از مواد مصرفی، محلول ها و موارد یکبار مصرف با تاریخ مصرف مناسب استفاده می نمایند. نسبت به تعویض قطعات تجهیزات مانند کپیلاری، لیزر و ... به موقع اقدام می کنند. در پلیت نمونه ها حتما از کنترل داخلی استفاده می نمایند. از موارد یکبار مصرف مانند پلیت فقط برای یکبار استفاده می کنند و آنها را دوباره نمی شویند و مورد استفاده مجدد قرار نمی دهند.

 

 

 
درخواست تکرار:
 

در کنار تمام نکات ذکر شده اگر نتایج نامطلوب مربوط به خطای اپراتور، مواد مصرفی و یا تجهیزات باشد روند نتایج نامطلوب باید در بیشتر نمونه ها قابل مشاهده باشد. ما برای مورد آزمون قرار دادن این موضوع هرگز نمونه های یک محقق را به تنهایی ارسال نمی کنیم و حتما نمونه های سایر محققین را نیز جهت کنترل کار آزمایشگاه همراه می کنیم. لازم به ذکر است در تعداد موارد بسیار معدود وجود حباب های ریز هوا باعث دریافت نتایج بد می شود که این مورد با کمی آنالیز و دقت قابل تشخیص است.

لطفا توجه نمایید با اینکه خدمات تکرار به عنوان پیشنهاد مربوط به خدمات مشتریان و به صورت رایگان از طرف آزمایشگاه ها ارائه می گردد ولی متاسفانه یا خوشبختانه به طور کلی آزمایشگاه ها تمایل چندانی به انجام خدمات تکرار ندارند زیرا این کار برای تمام آزمایشگا ها هزینه بر است بنابراین ما به عنوان همراه و مشاور شما اکیداً توصیه می کنیم جهت ذخیره زمان و منابع مالی خود و نیز سهولت آزمایش، کلیه مراحل کنترل کیفی نمونه ها را در آزمایشگاه خود انجام دهید و نسبت به ارسال نمونه با کیفیت به آزمایشگاه اقدام نمایید.

ما بنا به درخواست شما قادر هستیم خدمات تکرار را به صورت رایگان انجام دهیم. لطفا توجه نمایید این درخواست فقط برای تعدادی از نمونه ها امکان پذیر است. در صورت تکرار و دریافت نتایج متفاوت امکان درخواست تکرار سایر نمونه های معیوب نیز به ازمایشگاه وجود دارد زیرا می توان تا حدودی اثبات کرد نتایج معیوب در اثر خطای انسانی و یا تجهیزات به وجود آمده است ولی در صورت دریافت نتایج مشابه امکان درخواست تکرار بیشتر وجود ندارد و آزمایشگاه بابت درخواست تکرار بیشتر محقق را شارژ خواهد کرد لذا توصیه می کنیم پیش از درخواست تکرار از ایراد کار کاملا مطمئن شوید و ما را در جریان امور قرار دهید.

 
  
نکات مفید:
 
لطفاً توجه نمایید با توجه به عدم مطلوبیت ابتدای نتایج تعیین توالی (30 الی 100 نوکلئوتید ابتدایی) اکیداً توصیه می گردد فاصله ی محل طراحی پرایمر از شروع توالی حدود 100 نوکلئوتید فاصله داشته باشد.
 
جهت دریافت نتایج قابل قبول، نمونه DNA  باید عاری از هرگونه آلودگی باشد. اطمینان حاصل نمایید که به درستی از روش های پیشنهاد شده جهت آماده سازی و غلظت صحیح نمونه پیروی کرده باشید. تصور نکنید که اگر کیت خاص یا پروتوکل خاصی در آزمایشگاه دیگری کار می کند، با این سیستم هم کارا خواهد بود.
لطفاً متن ذیل را با دقت مطالعه فرمایید:
نمونه DNA باید به شکل یک قطعه PCR Product  خالص سازی شده و بدون هرگونه باند غیر اختصاصی باشد، بدین معنی که اگر شما بیش از یک باند غیر اختصاصی در نمونه خود دارید، باید از طریق Gel extraction، باند غیر اختصاصی را حذف نمایید، در غیر اینصورت تعیین توالی شما fail  خواهد شد.
پرایمرهای Universal نظیر… T7,T3,SP6,M13F,M13R, در آزمایشگاه موجود است و نیازی به ارسال آنها نیست. مابقی پرایمرها همراه نمونه ارسال شده یا توسط ما سنتز خواهد شد.
جهت دریافت نتیجه ای مطلوب،  PCR Productباید خالص سازی شود، خواه تصویر باند شما خوب باشد یا خیر؛
نمونه ای از تصویر یک باند بی کیفیت :
 
بهینه سازی نمونه نوع نمونه توضیحات
PCR Purification لازم است PCR Product

زمانی مورد استفاده قرار می گیرد که باند شما:

شارپ، بدون smear ، بدون باند غیر اختصاصی، دارای نمک، دارای پروتئین و ... (ناخالصی ها) و یا آلودگی های RNA باشد.

این روش خالص سازی فقط می تواند Primer-Dimer و خرده ناخالصی ها را حذف کند.

(ما این کار را بنا به درخواست شما انجام می دهیم)
Gel Extraction لازم است PCR Product

این روش خالص سازی می تواند باند غیر اختصاصی شما را حذف کند.

(ما این کار را بنا به درخواست شما انجام می دهیم) 
 
 در زیر تعدادی نمونه از باندهایی که احتیاج به PCR Purification  یا Gel Purification دارند دیده می شود.
 
 
 
کیفیت و کمیت پرایمرها:
معمولا غلظت پرایمر 100uM, Stock می باشد. اما در بعضی موارد، پرایمر پس از طی نمودن چند مرتبه چرخه انجماد / ذوب کیفیت اولیه را نخواهد داشت. بنابراین لطفاً قبل از ارسال پرایمرها برای ما، کیفیت آنها را با run  کردن ul 2-3 از پرایمر stock روی ژل آگاروز 1.5% کنترل نمایید.
اگر پرایمر شما مطابق تصویرفوق (A&B) باشد، از کیفیت خوبی برخوردار است.
لطفاً در نظر داشته باشید وجود یک نمونه خوب تنها دلیل برای داشتن پرایمر خوب نیست. شما ممکن است حتی با یک پرایمر ضعیف باند خوبی داشته باشید. بنابراین برای داشتن نتایج مطلوب چنانچه در بالا توضیح داده شد، قبل از ارسال، پرایمر را کنترل نمایید.
برای مثال تمام پرایمرهای بالا(A,B,C ,D)   روی آگاروز 1.5 %، PCR Product  داشته اند، اما فقط پرایمرهای  (A&B) نتایج تعیین توالی خوبی داشتند.
 Runکردن نمونه روی ژل یکی از روشهای سنجش کیفیت نمونه خواهد بود. نمونه باید تک باند و بدون smear باشد.وجود هر گونه باند غیر اختصاصی باعث fail  شدن نتایج می شود.Purification باعث حذف باند غیراختصاصی نمی شود.
 
معرفی تعیین توالی:
 
تعیین توالی DNA تکنیکی است که از دهه 70 درجهان آغاز شد و روشی برای شناسایی توالی بازهای موجود در ژنوم (A,T,C,G) مي باشد.
 
 
تعيين توالي تشخيصی جهت تشخيص موتاسيون (جهش) و ... وتعيين توالي تحقيقی معمولاً جهت شناسايي توالی  ژن های جدید مورد استفاده قرارمي گیرد.
 
 
روش های متداول انجام تعیین توالی DNA :
 
  1. زنجیره انتهایی یا روش Dideoxy که روش Sanger در این دسته قرار می گیرد.
  2. تعیین توالی شکاری یا Shotgun Sequencing
  3. تعیین توالی نسل جدید یا Next Generation sequencing-NGS که روش Pyrosequencing در این دسته قرار می گیرد.
در حال حاضر شركت فزاپژوه با تكنيك هاي Sanger و Next Generation Sequencing آماده خدمات رساني به محققين گرامي مي باشد.
 
 
معرفی روش Sanger sequencing :
 
روشSanger  بر گرفته از نام فردریک سنگر می باشد. این دانشمند برجسته برنده جایزه نوبل در سال 1958 برای شناسایی توالی اسید آمینه پروتئین و در سال 1980 برای تعیین توالی DNA است.در شکل زیر جزئیات این روش را ملاحظه می قرمایید:
 
 
روش کار :
در ابتدا با اضافه کردن "ddNTPs " واکنش های تفکیک شده انجام می گردد:
 
 
 سپس در 4 ستون مختلف ژل، Gel running صورت می گیرد:
 
 
در انتها توالی ها از قسمت پایینی ژل خوانده می شوند: (قطعات کوتاهتر بدلیل سبک بودن از لحاظ جرم مولکولی در قسمت های پایینی ژل قرار می گیرند)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
در مرحله بعدی به منظور ردیابی محصولات واکنش، بایدآنها را با رادیواکتیو یا فلورسانس نشاندار کرد، در این مرحله محصولات نشاندار شده تحت تابش اشعه لیزر قرار می گیرند که در نهایت با آنالیز دستگاه sequencer ، نتایجی مشابه شکل زیر بدست می آید:
 
 
 
کیفیت گراف ها و دقت نتایج بدست آمده، با چگونگی تهیه نمونه، ارتباط مستقیم دارد.
نمودار فوق مربوط به نمونه ایی است که طبق الگوی پیشنهادی تهیه شده است، همانطور که در شکل ملاحظه مي شود، تمامی پیک ها کاملا واضح بوده و به درستی نوع بازهای آن تشخیص داده شده است .
 
 
تعیین توالی شکاری یا  :Shotgun Sequencing
 
 
 
نسل جدید تعیین توالی Next Generation Sequencing 
 
يكي از جدید ترین متدهای تعيين توالي كه نسبتاً با هزينه كمترهمراه با اطلاعات بسیار زیاد انجام می شود تعيين توالي به کمک این روش مي باشد.
جهت کسب اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک نمایید.
 
 
معروفترین شرکت های سازنده دستگاه های Genetic Analyzer یا  Sequencer
 
درحال حاضردر دنيا تعدادي از شرکت های مطرح نظير Applied bioSyestems (ABI) ،Beckman Coulter ،Roche  ،LI-COR، Illumina  و... در حال عرضه دستگاه Sequencer مي باشند.
شركت فزاپژوه خدمات تعیین توالی به روش Sanger را بوسیله دستگاهABI 3730 XL  و خدمات NGS  را به کمک دستگاه  llumina از كشورآمريكا به محققان عزيز ارائه مي دهد.
ABI 
Illumina
 
 
مهمترین پایگاههای داده اطلاعات تعیین توالی (Databases of sequence information) 
 
مهمترین مرحله انجام تعيين توالي، جمع آوری اطلاعات خام و تبدیل آنها به دانشی قابل استناد می باشد.
به عنوان مثال به منظور سهولت آزمایشات محققان، تمام توالی هایی که تا کنون مورد بررسی قرار گرفته اند در بانك ژني موسوم به GenBank ®  موجود می باشند تا به عنوان يك مرجع براي همه قابل دسترس باشد.
جهت بررسي نتايج تعيين توالي خود مي توانيد به لينك هاي زير مراجعه كنيد:
GenBank www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank
EMBL www.ebi.ac.uk
DDBJ www.ddbj.nig.ac.jp
 
کپی از اطلاعات وب سایت فزاپژه با ذکر منبع مجاز است.